葉綠素測定儀：漫反射葉綠素儀原理與實例

漫反射式葉綠素測試技術(shù)的研究與實驗

*作物葉綠素檢測是農(nóng)作物科學(xué)施肥或植物脅迫診斷的重要依據(jù)。是把作物營養(yǎng)科學(xué)管理延伸到作物生長的全過程，實現(xiàn)農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化不可或缺的技術(shù)措施。近十幾年在教學(xué)科研領(lǐng)域廣泛應(yīng)用的葉綠素儀，可以在田間直接測定葉片葉綠素指數(shù)，具有無損傷、無耗材、低成本、高效率的特點。但其測值并不是葉綠素的含量，而是一個在一定條件下與葉綠素含量相關(guān)的指數(shù)。其相關(guān)關(guān)系具有很大的不確定性。所建立的相關(guān)模型往往只適用于具體的作物、品種和季節(jié)及特定的第幾個葉片。因而給具體應(yīng)用者帶來較繁瑣的建模工作量。本研究針對這一狀態(tài)，試圖開拓一種適用于作物不同品種、不同生育期的葉綠素含量直讀測定儀。

一．葉綠素測定儀的現(xiàn)狀與評價：

市場上的“葉綠素儀”都是透射式的。即通過檢測光線透過葉片的光強來測算葉綠素含量。如SPAD 502plus葉綠素儀:（日本柯尼卡美能達(dá)公司生產(chǎn)），CCM--200型手持葉綠素計（美國OPTI電器公司生產(chǎn)），atLEAF葉綠素儀（美國FT綠色有限公司產(chǎn)品），CL-01葉綠素儀（英國Hansatech公司產(chǎn)品）：他們普遍采用在兩個波長（650-660nm，935-940nm）下葉片的的透射率作為基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并把計算結(jié)果稱作葉綠素指數(shù)，表征葉綠素含量的高低。例如SPAD 502葉綠素儀的指數(shù)為SPAD值, CCM葉綠素儀的指數(shù)為CCI 值。不同的廠家定義有不同的指數(shù)。

這種方法存在幾個根本性缺陷：

1）當(dāng)葉綠素含量高或葉片厚度大時，透射率過小。例如SPAD502規(guī)定其最大測量葉片厚度為1.2mm，測值SPAD超過50時，精度不能保證。使用中也發(fā)現(xiàn)隨著測值的提高測值曲線出現(xiàn)平臺，且數(shù)據(jù)分散度加大。這是由于葉片透光度很低，當(dāng)透射光強度小于或近似于光路、電路噪音時，就達(dá)到了測試極限。這是透射法的原理內(nèi)在的固有性缺陷。

2）透射法的基礎(chǔ)是朗伯-比爾定律，是在透明物質(zhì)，可忽略其散射影響條件下建立的。但葉片是一種透明度很低的物質(zhì)，其散射量是不可忽略的，因此透射法葉綠素儀必然只能在一個具體散射條件下相互比較，而葉片的散射隨葉片內(nèi)部組織、筋脈、基質(zhì)背景變化而不同、這是透射法只能得到一個相對指數(shù)的根本原因，是又一個內(nèi)在的原理性、固有性缺陷。

3）葉片葉綠素主要存在形態(tài)：葉綠素a和b，二者的光吸收系數(shù)不同，當(dāng)葉綠素a和b的比例變化時，估算總量的模型必然就會出現(xiàn)失準(zhǔn)。加以葉片背景散射條件也會發(fā)生變化，因此透射式葉綠素儀的估測模型在不同作物、不同生育季節(jié)是不能通用的，其指數(shù)和葉綠素含量的關(guān)系，需要重新進(jìn)行建?；驑?biāo)定。帶來工作量增加和校正誤差的積累。

4）使用的1個工作波長（650~660nm）光源，和一個參考波長（940~950nm），測得的光吸收是葉綠素a(chlla)和葉綠素b(chllb)二者的光吸收的混合量，因此只能估測chla和chlb的總量，不能測知葉綠素chla和chlb的比例。而chla/chlb比值是作物病理診斷和栽培管理的的重要參數(shù)。

★透射法葉綠素儀自問世以來已有近30年歷史，目前止步于估測葉綠素a、b混合總量，不能前進(jìn)到葉綠素a、b比值。更不能由指數(shù)估測進(jìn)展到定量估測。主要是受到了透射原理的制約，即使增加了波長也無法獲取散射的信息。

二. 漫反射式葉綠素儀研究與進(jìn)展

1. 漫反射式葉綠素儀的原理簡述：

一束的光線照葉片上會產(chǎn)生吸收、透射和散射。漫反射式葉綠素儀是用一種特定工作波長的光源照射葉片，使用白板把穿過葉片的透射光再反射回來。在葉片內(nèi)部二次吸收和二次散射。在葉片的入射光一側(cè)接收漫反射光。工作波長的漫反射光強反映了葉片葉綠素的吸收和葉片的散射。另選一種參考波長（例如940nm）的光源，照射葉片。在該波長下葉綠素?zé)o吸收，其漫反射光強只與葉片內(nèi)部的其他組織的吸收、散射有關(guān)?？捎盟鼇硐ぷ鞑ㄩL下的葉片組織散射和吸收的影響。得到只與葉綠素含量有關(guān)的反射光強。從而建立起漫反射光強與葉綠素含量的相關(guān)模型。由于品種變化、季節(jié)變化所帶來的散射變化，在工作波長下與參考波長下有密切關(guān)聯(lián)?？梢愿鶕?jù)參考波長的散射來修正工作波長下的葉片組織的散射量。因此這一模型大大減少了葉片品種、季節(jié)變化引起的散射的變化帶來的模型誤差。是模型具有必要的兼容性，使之在不同品種、在不同季節(jié)可以共用同一個模型。

目前，我河南農(nóng)大迅捷測試技術(shù)公司研發(fā)了兩種漫反射式植株營養(yǎng)速測儀。一種指數(shù)型（YN-XJZS型）是采用650nm做工作光源，它與SPAD-502相比較，波長項同，只是將透射改為漫反射，實現(xiàn)了測試葉片厚度和葉綠素濃度不受限制，工作曲線沒有平臺階段，可以測定每g葉片葉綠素總量mg數(shù)。擴(kuò)展了應(yīng)用范圍。另一種（YN-XJDL型）是采用波長645nm和663nm兩個工作光源。由于采用兩個工作波長，可以應(yīng)用長原理計算出葉綠素A和葉綠素B的含量，進(jìn)一步解決了葉綠素A和葉綠素B的定量估測。消除葉綠素A/B比值變化帶來的模型誤差。使本法所建立的模型在一定條件下具有相對普適性。從而大大減少建模的工作量。

本漫反射葉綠素測試技術(shù)，所依據(jù)的原理是在漫反射技術(shù)中普遍使用的庫貝爾卡--芒克函數(shù)（Kubelka-Munk function）：

K/S=(1－R) 2/2R ----------------------1）

式中K、S,分別為吸收量系數(shù)和散射量系數(shù)；R：反射率，

但是該函數(shù)只是原理性描述，用以表述吸收、散射和反射三者的物理關(guān)系。其中K和S都沒有單位。而且其R只在一定大小范圍內(nèi)時，其K值才與被測物質(zhì)的吸光度有線性關(guān)系。也就是說迄今漫反射的理論還沒有完全定量的函數(shù)描述。本研究是在其基礎(chǔ)上，通過實驗建立起經(jīng)驗?zāi)Ｐ汀Ｓ捎趯嶒炓?guī)模的局限性，其經(jīng)驗?zāi)Ｐ途筒豢赡苁瞧者m的。本研究建立的模型的目標(biāo)是在所實驗的作物上在不同品種、不同季節(jié)得到葉綠素A和葉綠素B的準(zhǔn)定量的數(shù)據(jù)，其誤差平均在8%以內(nèi)，最大誤差不超過15%.

2.漫反射式葉綠素儀的使用特點：

1）測試葉片部位和測試點的選擇：由于不同的葉片，不同的部位的葉綠素含量不同、葉片基質(zhì)也不同，所以測試點應(yīng)能與建模時選擇的測試點相同。并盡可能避開粗大的筋脈。這一點與透射式葉綠素儀（SPAD等）是相同的。但透射式葉綠素儀的模型對品種對季節(jié)不具兼顧性，所以全靠用戶自己進(jìn)行實驗室實驗來建模，自己選擇測試點。而漫反射式葉綠素儀的模型具有這種兼顧性，可以制成某一作物專用儀。因此，使用者不必自己建模，只需按照說明書指定的葉片位置、測試點進(jìn)行檢測。當(dāng)需要使用該專用儀測試其他作物，又不準(zhǔn)備另購一臺專用儀時，或當(dāng)選擇的葉片位置或測試點與說明書不一致時，就需要再做一次實驗室常規(guī)測定，建立葉綠素儀測值與常規(guī)測值的簡單換算關(guān)系（y=a+bx，x為葉綠素儀讀數(shù)，y為葉綠素含量）。這樣就可以把一種作物的葉綠素專用儀擴(kuò)展為多種作物共用的葉綠素儀。

2）葉片測試方向：葉片的兩面表面狀態(tài)不同，要選擇無絨毛的、較光潔。較平整的一面面對入射光方向。以免部分入射光被絨毛反射后進(jìn)入檢測器，而這部分進(jìn)入檢測器的光未能進(jìn)入葉片內(nèi)部，不能反映葉片內(nèi)的葉綠素的吸收和散射，只能是一種隨機(jī)干擾，會帶來誤差。它對漫反射式儀的影響大于對透射式儀的影響。

3）漫反射式葉片測試數(shù)據(jù)分散性一般大于透射式數(shù)據(jù)。其原因在于它不僅受到葉片群體葉綠素含量變異的影響，還受到葉片群體葉片內(nèi)部組織變異的影響。但是這些變異都是隨機(jī)的，并不影響測值的總體精度。

參見下表：

作物（n）測值變異系數(shù)測值與常規(guī)平均偏差備 注透射式漫反射式透射式漫反射式透射式使用SPAD-502漫反射式使用YN-XJZS玉米葉（13）13.3%15.4%7.11%7.31玉米葉（16）15.7%21.32%12.2%8.2%丁香葉（10）18.2%20.6%16.85%7.24%引自2014年10月29日YN-XJZS第一代樣機(jī)某實驗記錄。（數(shù)據(jù)量過小，數(shù)據(jù)只用于分散度對比）

4）測試數(shù)量：不論透射式還是漫反射式葉綠素儀，其目的都是測定作物群體的營養(yǎng)狀態(tài)，而不是單個葉片的營養(yǎng)狀態(tài)。因此必須有一定的葉片測試數(shù)量，剔除粗大誤差后以其平均值代表作物的葉綠素A和B的含量。增加測試數(shù)量，可以提高測試精度，一般30-40個葉片就可以滿足判斷葉綠素豐缺的測試精度要求。最低不應(yīng)少于20個葉片.當(dāng)用于建模時建議取40-60個葉片。繼續(xù)增加葉片數(shù)量的效果有限。漫反射式葉綠素儀的測值既受葉綠素含量分散相的影響，又受葉脈和內(nèi)部組織分散性影響，因而測值的變異性略大于透射式葉綠素儀，但是由于都是隨機(jī)的變異，所以不影響平均值的精度。

4）必須保持反射板的清潔和表面狀態(tài)：反射板俗稱（白板）是由低密度聚四氟乙烯材料制成，它是漫反射式葉綠素儀的基準(zhǔn)組件。使用時需注意不要用手觸及其表面。當(dāng)表面臟污時儀器會自動提醒進(jìn)行維護(hù)或更換，維護(hù)時按照說明書要求進(jìn)行。

3.漫反射式葉綠素儀的已達(dá)到的指標(biāo)：

1）解決了深色葉片、大厚度葉片的檢測的適應(yīng)性，葉片厚度未受限（＞8mm），遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過SPAD葉綠素儀的葉片厚度上限（1.2mm）。葉綠素線性區(qū)間未受限制（＞0-8mg/cm2），葉綠素曲線無平臺。遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過SPAD指數(shù)的線性區(qū)間上限（50SPAD，相當(dāng)于 mg/cm2）。

附圖：透射式和漫反射式儀器的測值曲線（待補）.

2）解決了當(dāng)前國內(nèi)外葉綠素儀只能提供一個指數(shù)，不能提供葉綠素值的問題。把葉綠素的無損快速測定由半定量估測提高到定量估測，直接顯示葉片葉綠素含量。其葉綠素讀數(shù)與Arnon法測定的測值相比較，按最近實驗，其平均相對偏差為5.97%，相關(guān)性R的置信水平達(dá)0.01以上（9種樹葉，見表1）

3）直讀葉綠素A、B的各自含量，直讀其比值：chlla/chllb。該比值與Arnon法測定的比值相比較，其平均相對偏差為4.28%：（9種樹葉，見表1）

表1：葉綠素模型兼容性檢驗

品種樣本數(shù)nChll項目ARNON測值迅捷儀器測值相對偏差（%）估測模型的相關(guān)性R相關(guān)性臨界值(f=n-2)0.050.010.001牡丹28a+b4.03993.606510.70.9133＊＊＊0.3170.3740.588a/b3.98633.98110.11木瓜海棠24a+b5.11354.87164.730.8996＊＊＊0.3440.4040.625a/b3.78853.84011.35木香25a+b4.55784.28046.100.8832＊＊＊0.3370.3960.618a/b3.72213.86393.81西府海棠32a+b3.62223.97999.880.9688＊＊＊0.2960.3490.554a/b4.50043.9668.81榆葉梅29a+b3.67984.145412.70.9395＊＊＊0.3110.3670.579a/b3.83423.86050.69月季27a+b4.87284.87090.0010.9481＊＊＊0.3230.3810.597a/b3.80493.81280.21紫丁香20a+b4.20943.95306.100.9101＊＊＊0.4440.5610.679a/b4.64133.986914.1素馨28a+b3.91863.92410.1380.9484＊＊＊0.3170.3740.588a/b3.63783.91117.69貼桿海棠20a+b4.21894.07333.450.9706＊＊＊0.4680.5900.708a/b3.93464.00321.74注：前5項作物數(shù)據(jù)用于建模，后4項作物數(shù)據(jù)用于模型兼容性檢驗

漫反射式葉綠素儀在建立了某種作物的兼容性計算模型之后，用戶可以擺脫自己建模對實驗室的依賴，就能直接進(jìn)行葉綠素含量的定量檢測，無損傷、無耗材?？旖?、方便，是目前作物營養(yǎng)檢測的理想工具。但是操作人員必須了解漫反射的特點。按照操作要求維護(hù)使用，才能保證測試精度。

四．結(jié)語：

透射式葉綠素儀面世以來，推動了植株營養(yǎng)的檢測技術(shù)的應(yīng)用，但它不能進(jìn)行定量估測，用其指數(shù)建模又不具對不同生育期、不同品種的兼容性。因而迄今只是在研究單位中得到應(yīng)用，不能普及到基層用戶。其根本原因是葉片的非透明性，透射原理不適于檢測具有較強散射性的物質(zhì)。漫反射式葉綠素儀不僅可以獲取葉片的葉綠素吸收信息，還可以獲取葉片的散射信息。因而其模型具有一定的普適或兼容性，可以對葉綠素進(jìn)行定量估測，但由于漫反射理論尚未成熟，沒有精確地計算式，也沒有適用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行校準(zhǔn)。不得不使用經(jīng)驗公式進(jìn)行估測，所以目前只能做到準(zhǔn)定量。但初步實踐表明，其精度可以滿足作物生育期營養(yǎng)監(jiān)測的要求。為了該技術(shù)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中發(fā)揮應(yīng)有的作用，需要作物營養(yǎng)與施肥戰(zhàn)線的技術(shù)人員共同努力，與制造廠家合作，給農(nóng)民提供各種作物的專用模型和施肥技術(shù)指標(biāo)體系。作為漫反射式葉綠素儀的創(chuàng)始研制者，我河南農(nóng)大迅捷測試技術(shù)有限公司愿與各位專家學(xué)者合作，利益共享，共同完成這一義舉。

河南農(nóng)大迅接測試技術(shù)有限公司

聯(lián)系人：楊張青，

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